Um den äußerst komplexen Photosynthese-Prozeß besser verstehen zu können, ist es erforderlich, die verschiedenen Elementarprozesse getrennt zu betrachten. Nachdem bei der natürlichen Photosynthese die Lichtenergie über sogenannte Antennenpigmente eingefangen und zum photoaktiven Reaktionszentrum geleitet wurde, wird an den dort vorhandenen Pigmenten ein Elektronentransfer durch die photosynthetische Membran angeregt. Es resultiert ein Membranpotential, das den Aufbau energiereicher Moleküle ermöglicht. Die Biosynthese der Kohlenhydrate ist das wohl bekannteste Beispiel für die Umwandlung von photoelektrischer in gespeicherte chemische Energie.1
Ein photoaktives Reaktionszentrum aus einem pflanzlichen Photosystem konnte bis heute nicht kristallisiert werden, so daß zwar über verschiedene analytische Verfahren eine große Anzahl an Informationen über die Pigmente erhalten wurden, aber eine Röntgenstrukturanalyse zur Klärung der Umgebungsstruktur nicht vorhanden ist. Dies ist ein überaus wichtiges Argument für die bevorzugte Untersuchung von Photosystemen aus photosynthetisch aktiven Bakterien. Die Anzahl aller Pigmente ist in diesen Systemen deutlich kleiner als bei den Pflanzen, da nur ein Photosystem vorhanden ist. Die grünen Pflanzen benötigen die beiden Photosysteme, um die Elektronen von einem sehr hohen zu einem niedrigeren Redox-Potential zu transportieren, damit der Elektronendonator Wasser Kohlendioxid reduzieren kann. In der bakteriellen Photosynthese werden der leichter oxidierbare Schwefelwasserstoff oder organische Reduktionsmittel benutzt, um Kohlendioxid zu assimilieren.
Die Isolation eines Reaktionszentrums aus einer photosynthetischen Membran gelang zuerst D. W. Reed und R. K. Clayton im Jahre 1968.2 Es handelte sich hierbei um das Reaktionszentrum des photosynthetisierenden Bakteriums Rhodopseudomonas sphaeroides. Die EPR-Spektroskopie und die davon abgeleiteten Methoden (ENDOR, TRIPLE, ESE, CIDEP usw.) eignen sich vorzüglich, wichtige Strukturparameter der Reaktionszentren zu entschlüsseln.3 Durch den lichtangeregten Elektronentransfer entstehen in den Reaktionszentren kurzlebige, paramagnetische Spezies. An einem Bakteriochlorophyll-Dimer-Kationradikal (P870+*) eines Reaktionszentrums in Lösung (in vivo) wurden schon 1971 von J. R. Norris et al.4 EPR-Messungen durchgeführt. Ein Durchbruch gelang bei der Aufklärung der Struktur eines ähnlichen Photosystems durch R. Huber, J. Deisenhofer und H. Michel, die nach Kristallistion des Reaktionszentrums von Rhodopseudomonas viridis die erste Röntgenstrukturanalyse von den Pigmenten und ihrer Proteinumgebung publizierten.5 Diese bahnbrechende Arbeit wurde 1988 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.
Seit dieser Pionierleistung ist es nun mehreren Forschungsgruppen (Allen, Feher, Norris, Lubitz)6 gelungen, Reaktionszentren aus photosynthetisch aktiven Bakterien zu kristallisieren. Bei den Purpurbakterien Rhodobacterium spheroides (Rb.), Rhodospirillum rubrum (Rs.) und Rhodopseudomonas viridis (Rps.) konnten erfolgreich Antennenkomplex und Reaktionszentrum getrennt isoliert werden.7
Im Reaktionszentrum von Rhodopseudomonas viridis sind Bakteriochlorophyll-b, Bakteriophäophytin-b und Menadione, sowie die zusätzliche Proteineinheit Cytochrom enthalten. Bei der Röntgenstrukturanalyse von J. Deisenhofer et al. fehlten im untersuchten Reaktionszentrum die Cytochrom-Proteineinheit und eines der beiden Menadione. Anhand der Abbildung ist deutlich zu erkennen, daß die Pigmente des Reaktionszentrums annähernd C2-symmetrisch angeordnet sind. Nach der Lichtanregung des primären Donors, dem Chlorophyll-Dimerkomplex (special pair), wird ein Elektron über eine Reihe von Zwischenschritten transferiert. Die Ladungstransportkette der photoinduzierten Elektronentransfer-Reaktion (PET-Reaktion) ist definiert durch die einzelnen Elektronenübertragungsraten ausgehend vom primären Donor (Dimer) über ein weiteres Bakteriochlorophyll zum primären Akzeptor, dem Bakteriophäophytin, bis zu den sekundären Akzeptoren, den Menadionen. In der zweiten Abbildung ist diese Ladungstransportkette schematisch dargestellt. Die hohe Effizienz dieses ET-Prozesses beruht auf der Tatsache, daß die Elektronentransferraten der zur Ladungstrennung führenden Hinreaktion in jedem Teilschritt um mindestens eine Größenordnung höher sind als die Transferraten für die Rückreaktion oder die Ladungsrekombination zum Grundzustand.
Trotz der annähernd C2-symmetrischen Anordnung der Pigmente sind die Transferraten in beiden Pigmentzweigen stark unterschiedlich. Optische Messungen ergaben, daß der Elektronentransfer hauptsächlich über den L-Zweig abläuft.8 Die Klärung der Ursachen für diese Unsymmetrie der PET-Reaktion ist Gegenstand mehrerer wissenschaftlicher Arbeiten. Es gibt Hinweise, daß der Elektronentransfer nicht nur von den elektronischen Eigenschaften der Pigmente abhängt, sondern auch von der unmittelbaren Proteinumgebung der Pigmente beeinflußt wird.8 Mit paramagnetischen Resonanzmethoden wurden die einzelnen Pigment-Radikalionen in vitro eingehend untersucht.9 Die hieraus erhaltenen spektroskopischen Daten dienten zur Bestimmung der Spindichteverteilung und der räumlichen Struktur von Donor und Akzeptoren. Diese Ergebnisse sind unverzichtbar für die Interpretation der Messungen an in-vivo-Systemen. So wurden durch selektive Radikalerzeugung die jeweiligen Pigmente in aktiven Reaktionszentren (in vivo) mit der ENDOR-Spektroskopie untersucht.10 Seitdem Einkristalle von Reaktionszentren gezüchtet werden können, zeigt sich großes Interesse an ENDOR-Einkristall-Studien.11 Die Messungen an gefrorenen Lösungen und an Einkristallen haben es ermöglicht, Wechselwirkungen der Pigmente mit der Proteinumgebung nachzuweisen und zu spezifizieren.10,11
Durch die Anwendung zeitaufgelöster EPR-Methoden (transiente EPR, CIPEP, usw.) kann der photoinduzierte Elektronentransfer (PET) des Reaktionszentrums anhand der auftretenden paramagnetischen Zustände untersucht werden.12 Obwohl die Reaktionszentren intensiv studiert wurden, ist das komplexe Zusammenspiel der Pigmente untereinander und mit der Umgebung bei weitem noch nicht aufgeklärt. Es werden noch sehr viel mehr Informationen über die Wechselwirkungen der Pigmente benötigt, um auch die Voraussetzungen für den Primärschritt in der Photosynthese zu verstehen. Deshalb sind Modellsysteme erforderlich, an denen die prinzipiellen Schritte des PET studiert werden können. Diese Systeme gelten als biomimetisch, wenn sie den natürlichen Reaktionszentren nachempfunden sind. Als gutes Beispiel für biomimetische Modellverbindungen zum PET können die kovalent verknüpften Porphyrin-Chinone bezeichnet werden.13 Da im Reaktionszentrum der Donor aus einem Chlorophyll-Dimer-Komplex besteht, werden z. B. auch Porphyrin-Dimere als Modelle untersucht.14 Modellsysteme mit mehreren Donoren und Akzeptoren sind bereits synthetisiert und studiert worden.15
Außer für die Pigmente können zudem Modellsysteme für die photosynthetische Membran verwandt werden. Es wurden natürliche Pigmente, aber auch Modelldonoren und -akzeptoren in gefrorenen Vesikel-Lösungen, in Flüssigkristallen und in mizellaren Systemen mit EPR-Techniken untersucht.16
Spezielles Interesse gilt der Darstellung von Cyclohexyl- und Phenyl-1,4-benzochinonen. Erstmals soll ein 1,4-Benzochinon mit einem zweifach substituierten Cyclohexanderivat umgesetzt werden, wonach die Synthese von mehrfach alkylsubstituierten Cyclohexyl-1,4-benzochinonen folgen soll. Durch andere Synthesestrategien soll gezeigt werden, daß auch mehrfach substituierte Phenyl-1,4-benzochinone darstellbar sind. Zur Aufklärung der Struktur und Spindichteverteilung sollen diese Modell-Chinone nach der Reduktion zu Semichinon-Anionradikalen mit Hilfe der EPR- und ENDOR-Spektroskopie charakterisiert werden. Diese Messungen sollen außer in isotropen Lösungsmitteln auch in invers-mizellaren Systemen vorgenommen werden.
Erstmals soll eine systematische EPR/ENDOR-Untersuchung von Semichinon-Anionradikalen in invers-mizellaren Lösungen durchgeführt werden. Anhand des anisotropen Charakters der Radikalumgebung in inversen Mizellen sollen neue Aussagen über die Abhängigkeit der Spindichteverteilung von der Solvatisierung getroffen werden.
Die Pigmente sind relativ fest in die Proteine eingebettet, so daß die Abstände der Pigmente untereinander konstant sind. Die Anordnung von Donor und Akzeptor in den Modellsystemen sollte ebenfalls fest und wohl definiert sein. Dies wird durch eine kovalente Verknüpfung von Donor und Akzeptor über starre Brückenmoleküle erreicht.
Als Abstandshalter (spacer) können aliphatische Ketten oder aliphatische bzw. aromatische Ringe verwandt werden, wobei die unterschiedlichen chemischen Verknüpfungsmethoden (C-C-, C-N-, C-O-Bindung etc.) eingesetzt werden können.
Als Elektronenakzeptoren bieten sich Chinone an. In den Reaktionszentren wurden vor allem Menadione, Plasto- und Ubichinone nachgewiesen. Diese sind 1,4-Benzo- bzw. 1,4-Naphthochinon-Derivate, die mit einer isoprenoiden Seitenkette substituiert sind. Diese Seitenkette dient nicht nur zur Verankerung im Proteingerüst, sondern beeinflußt auch die Elektronenaufnahme. In der Regel werden die Redox-Potentiale von Chinonen empfindlich durch Substituenten beeinflußt. Elektronenziehende Substituenten (Halogen-, Pseudohalogen, Cyano-Gruppen etc.) erhöhen und elektronenschiebende Reste (Alkyl-, Aryl-, Alkoxy-, Amino-Gruppen etc.) erniedrigen das Redox-Potential der Chinone.17 Interessant ist auch die Alternative, 1,2-Benzochinone als Akzeptoren einzusetzen, da diese Chinone generell höhere Redoxpotentiale als 1,4-Benzochinone besitzen.
Insgesamt stellt die Modellverbindung ein aliphatisch oder aromatisch verknüpftes Porphyrin-Chinon-System dar. Das Redoxverhalten zwischen Donor und Akzeptor kann auf der Porphyrinseite durch den Einbau von zweiwertigen Metall-Ionen und auf der Chinonseite durch Substituentenvariation verändert werden, so daß die elektronischen Parameter für eine PET-Reaktion zu Genüge variiert werden können. Nach der Theorie der ET- und PET-Reak-tionen ist eine große Abhängigkeit dieser Reaktionen vom der chemischen Umgebung anzunehmen. So sind bei den Modellsystemen erhebliche Unterschiede in den verschiedensten Lösungsmitteln für die ET-Raten zu erwarten und wurden z.T. schon nachgewiesen.18
Die Solvatisierung der Pigmente ist von mehreren Faktoren abhängig. Da bei PET-Reaktionen kurzlebige Radikalionen entstehen, sind Polarität und Polarisierbarkeit des Lösungsmittels wichtig. Die Viskosität des Lösungsmittels ist ausschlaggebend für die Beweglichkeit der Pigmente und für den zeitlichen Ablauf der Lösungsmittelreorganisation.
Große Erwartungen werden Messungen in Flüssigkristallen, in Mizellen und inversen Mizellen entgegengebracht. Diese anisotropen Medien zeichnen sich durch besonders hohe Viskosität, Ordnung und Membranähnlichkeit aus. Abschließend ist also festzuhalten, daß zum Verständnis der lichtinduzierten Ladungstransferreaktionen in Photosystemen naturähnliche Modellsubstanzen synthetisiert und untersucht werden müssen. Die kovalent verbundenen Porphyrin-Chinon-Komplexe sind strukturverwandt zu den Pigmenten in den natürlichen Photosystemen, und können durch präparative Variation über die Veränderung der Redoxpotentiale und des Abstands für PET-Reaktionen eine Reihe neuer Informationen erbringen. Eine zusätzliche Optimierungsmöglichkeit für die Transferraten ergibt sich durch die systematische Untersuchung der Lösungsmittelabhängigkeit. Hochviskose und hochgeordnete Lösungsmittel dienen hierbei als Modellsysteme für das Proteingerüst in der photoaktiven Membran.
1,4-Benzochinone haben je nach Substituenten ein Oxidationspotential von ca. 0.6-0.7 V. Sie sind also starke organische Oxidationsmittel. Biologisch wichtige Chinone sind beispielsweise die Ubichinone (2,3-Dimethoxy-5-methyl-1,4-benzochinone mit isoprenoider Seitenkette), die Plastochinone (2,5,6-Trimethyl-1,4-benzochinone mit isoprenoider Seitenkette) und die Menadione (Vitamin K1 und K2: 2-Methyl-1,4-naphthochinone mit isoprenoider Seitenkette). Diese Chinone dienen als Elektronenakzeptoren in biologischen Redoxreaktionen (z.B. Photosynthese) und auch als Radikalfänger.
Hydrochinone sind dementsprechend gute Reduktionsmittel; das wohl bekannteste Hydrochinonderivat ist das fettlösliche Vitamin E (a-Tocopherol), das eine wichtige Rolle als Antioxidans in lipophilen Geweben einnimmt.
Die mittlere Redoxspezies zwischen Chinon und Hydrochinon, das Semichinon-Radikal, ist paramagnetisch. Dieses Radikal ist durch verschiedene Methoden zugänglich, so daß in alkalischen Medien Semichinon-Anionradikale, in neutral gepufferten Medien Neutralradikale und in stark sauren Medien Semichinon-Kationradikale erzeugt werden können.19
Erwähnenswert sind auch die Melanine (Polychinone), die als Pigmente z.B. in der Retina und in der Haut vorkommen. Die Melanine sind paramagnetisch, da in der Polychinon-Kette Semichinon-Radikale enthalten sind.20
Seit den Anfängen der paramagnetischen Resonanzspektroskopie wurden immer wieder umfangreiche Untersuchungen an Semichinon-Radikalen durchgeführt.1 Die Lebensdauer dieser recht gut zugänglichen Radikale ist relativ hoch. Ein sogar in Substanz isolierbares Semichinon-Radikal ist das Natrium-Salz des Durobenzosemichinon-Anionradikals (2,3,5,6-Tetramethyl-1,4-benzosemichinon-Anionradikal).1
Das Redoxpotential des Chinon/Hydrochinon-Systems ist hauptsächlich dafür verantwortlich, daß Chinone bzw. Hydrochinone in protischen Lösungsmitteln unbeständig sind. Chinone sind zudem lichtempfindlich; so können sie durch starke Lichtquellen leicht zum Semichinon-Radikal reduziert werden.21 Obwohl Hydrochinone in schwach alkalischem Medium schon durch Luftsauerstoff oxidiert werden können, sind sie in Festsubstanz recht beständig. An Hydrochinonen (1,4-Dihydroxybenzole) und Brenzcatechinen (1,2-Dihydroxybenzole) können die üblichen aromatischen Substitutionsreaktionen durchgeführt werden. Die meisten chemischen Reaktionen der Chinone sind primär Additionsreaktionen. Dies wird deutlich, wenn z.B. das 1,4-Benzochinon als doppeltes vinyloges System betrachtet wird. Nucleophile und radikalische Additionsreaktionen können demnach an einer der Carbonyl-Gruppen (1,2-Addition) oder vinylog als 1,4-Addition stattfinden.22
Für das Entwickeln von Synthesestrategien sind also die grundsätzlich verschiedenen chemischen Eigenschaften der Chinone und Hydrochinone bzw. Brenzcatechine zu berücksichtigen. Für die spekroskopische Untersuchung an den Semichinon-Anionradikalen muß geprüft werden, ob sich das Radikal leichter und in höheren Ausbeuten durch Reduktion aus dem Chinon oder durch Oxidation aus dem Hydrochinon erzeugen läßt. Die Darstellung von Semichinon-Anionradikalen durch die alkalische Reduktion von Chinonen zählt zu den zuverlässlichsten und einfachsten Methoden.23
Inverse Mizellen bilden sich durch das umgekehrte Aufbauprinzip. Invers- mizellare Lösungen sind "Wasser-in-Öl"-Mikroemulsionen, die sich in flüssigen Kohlenwasserstoffen durch Beigabe von Tensid und Wasser bilden. Dabei lagern sich die polaren Kopfgruppen des Detergenz zusammen und die lipophilen Ketten weisen nach außen. Innerhalb des Wassertröpfchens können polare, wasserlösliche Substanzen (Gastmoleküle) gelöst werden. Diese Systeme gelten als ein realistisches Modell für Biomembranen.24a
Wichtige Parameter sind bei invers-mizellaren Systemen die kritische Mizellenkonzentration (CMC) und das Konzentrationsverhältnis Tensid zu Wasser, der W0-Wert (W0=cTensid/cWasser).24b Als kritische Mizellenkonzentration wird die niedrigste Detergenzkonzentration für die Bildung von Mizellen bezeichnet. Die CMC eines Tensids nimmt in Abhängigkeit vom unpolaren Lösungsmittel unterschiedliche Werte an. Der W0-Wert ist der aussagekräftigste Parameter für invers-mizellare Lösungen. Es wird nahezu unabhängig vom Lösungsmittel für W0-Werte zwischen 10 und 25 ein annähernd linearer Zusammenhang zwischen Mizellengröße und W0-Wert gefunden.25 So kann der W0-Wert mit den von der Mizellengröße abhängigen Eigenschaften korreliert werden.
Bisher wurden meist Enzym-Reaktionen in diesem Modell für Biomembranen untersucht, wobei der Größe der inversen Mizelle besondere Bedeutung zukommt. Bei W0-Werten >5 ist das Wasser stark an die polaren Kopfgruppen der Detergenzmoleküle gebunden. Die physikalischen Eigenschaften des mizellaren Wassers unterscheiden sich dadurch deutlich von wäßrigen Lösungen. Ab einem W0-Wert von 10 bildet sich innerhalb der inversen Mizelle ein sogenannter "water pool",ein Wassertröpfchen, dessen Eigenschaften stark temperaturabhängig sind. Bei Temperaturen >20°C ist der Ordnungsgrad noch relativ hoch, wohingegen bei Temperaturen >40°C fast schon isotrope Verhältnisse vorliegen. Bei W0-Werten über 30 (ca. 10% H2O im Gesamtsystem) werden die Eigenschaften des Mizellen-Wassers annähernd identisch mit jenen wäßriger Systeme. Auch die Gastmoleküle und die Additive des wäßrigen Systems (Puffer, Salze etc.) beeinflussen die physikalischen Eigenschaften der invers-mizellaren Systeme. Speziell die Mizellengröße und Aggregationszahl werden hierdurch variiert.26 Durch Ultrazentrifugierung27 und Streulichtmessungen28 wird das Molekulargewicht, durch Neutronenstreuung29 oder Photonenkorrelationsspektroskopie26 wird der Durchmesser einer inversen Mizelle zugänglich.
Aus diesen Messungen sollte jedoch nicht abgeleitet werden, daß inverse Mizellen eine starre Struktur besitzen. Durch Zusammenstöße können die Mizellen koaleszieren, so daß sich größere Aggregate bilden.30 Zwischen den Mizellen kann auch ein Materieaustausch stattfinden, der wie bei Biomembranen über Kommunikationskanäle abläuft.30 Speziell diese Eigenschaften werden für Enzymreaktionen innerhalb der inversen Mizellen genutzt.31 Die von Wasser unterschiedlichen Eigenschaften des Mizellenwassers führen dazu, daß inverse Mizellen vorzüglich für EPR-Untersuchungen an wasserlöslichen Radikalionen geeignet sind (s. Allgemeiner Teil, Abschnitt 4.5, "EPR in inversen Mizellen").
Inverse Mizellen können mit beliebigen Tensiden aufgebaut werden. Das am meisten verwandte Detergenz ist das Aerosol OT (AOT= Natrium-1,2-bis-(2-ethylhexyloxycarbonyl)-1-ethansulfonat). AOT ist ein Anion-Tensid und ist in unpolaren Kohlenwasserstoffen (Hexan, Octan, iso-Octan usw.) gut löslich. Inverse AOT-Mizellen können über einen großen W0-Bereich (bis W0= 50) eingesetzt werden. Alternativ zu anionischen Seifen können Neutral- oder Kation-Tenside zur Bildung von inversen Mizellen eingesetzt werden. Neutrale Detergenzien, meist Polyoxyethylenalkylether wie Triton X (eine Mischung verschiedener Ether) oder Brij (z. B. Brij 56= Deca-(oxyethylen)-monocetylether), und Kation-Tenside, meist Tetraalkylammoniumhalogenide wie Cetyl- oder Lauryltrimethylammoniumbromid, lösen sich schlechter als AOT in unpolaren Kohlenwasserstoffen und benötigen daher eine Beimischung eines polareren Lösungsmittels (Chloroform, Dichlormethan, 1-Hexanol usw.).
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